Slangengif bevat enzymen die carboxylesterbindingen hydrolyseren.De substraten voor hydrolyse zijn fosfolipiden, acetylcholine en aromatisch acetaat.Deze enzymen omvatten drie soorten: fosfolipase, acetylcholinesterase en aromatische esterase.Arginine-esterase in slangengif kan ook synthetisch arginine of lysine hydrolyseren, maar het hydrolyseert voornamelijk eiwitpeptidebindingen in de natuur, dus het behoort tot protease.De hier besproken enzymen werken alleen op estersubstraten en kunnen niet op enige peptidebinding inwerken.Van deze enzymen zijn de biologische functies van acetylcholinesterase en fosfolipase belangrijker en deze zijn volledig bestudeerd.Sommige slangengif hebben een sterke aromatische esterase-activiteit, die p-nitrofenylethylester, a- of P-naftaleenacetaat en indoolethylester kan hydrolyseren.Het is nog onbekend of deze activiteit wordt geproduceerd door een onafhankelijk enzym of een bekende bijwerking van carboxylesterase, laat staan de biologische betekenis ervan.Toen men het gif van Agkistrodon halys Japonicus liet reageren met p-nitrofenylethylester en indoolethylester, werden de hydrolysaten van p-nitrofenol en indoolfenol niet gevonden;Integendeel, als deze esters reageren met cobra Zhoushan subspecies slangengif en Bungarus multicinctus slangengif, zullen ze snel worden gehydrolyseerd.Het is bekend dat deze cobra-gif een sterke cholinesterase-activiteit heeft, die verantwoordelijk kan zijn voor hydrolyse van de bovengenoemde substraten.Sterker nog, Mclean et al.(1971) meldde dat veel slangengif dat tot de Cobra-familie behoort, indool-ethylester, naftaleen-ethylester en butylnaftaleen-ester kan hydrolyseren.Dit slangengif is afkomstig van: cobra, zwarthalscobra, zwartlipcobra, gouden cobra, Egyptische cobra, koningscobra, gouden cobra mamba, zwarte mamba en witlipped mamba (D. aw kent nog steeds oostelijke rhombola ratelslang
Het slangengif kan methylindool-ethylester hydrolyseren, wat het substraat is voor het bepalen van de cholinesterase-activiteit in serum, maar dit slangengif vertoont geen cholinesterase-activiteit.Dit toont aan dat er een onbekende esterase in cobragif zit, die verschilt van cholinesterase.Om de aard van dit enzym te begrijpen, is verder scheidingswerk nodig.
1, fosfolipase A2
(I) Overzicht
Fosfolipase is een enzym dat glycerylfosfaat kan hydrolyseren.Er zijn 5 soorten fosfolipase in de natuur, namelijk fosfolipase A2 en fosfolipase
A., fosfolipase B, fosfolipase C en fosfolipase D. Het slangengif bevat voornamelijk fosfolipase A2 (PLA2), een paar slangengif bevat fosfolipase B en andere fosfolipases worden voornamelijk aangetroffen in dierlijke weefsels en bacteriën.Fig. 3-11-4 toont de actieplaats van deze fosfolipases bij substraathydrolyse.
Onder fosfolipases is PLA2 meer bestudeerd.Het is misschien wel het meest bestudeerde enzym in slangengif.Het substraat is de esterbinding op de tweede positie van Sn-3-glycerofosfaat.Dit enzym wordt veel aangetroffen in slangengif, bijengif, schorpioenengif en dierlijke weefsels, en PLA2 is overvloedig aanwezig in vier slangengiffamilies.Omdat dit enzym rode bloedcellen afbreekt en hemolyse veroorzaakt, wordt het ook "hemolysine" genoemd.Sommige mensen noemen ook PLA2 hemolytische lecithinase.
Ludeeke ontdekte voor het eerst dat slangengif een hemolytische verbinding kan produceren door via enzymen op lecithine in te werken.Later hebben Delezenne et al.bewees dat wanneer cobragif inwerkt op paardenserum of dooier, het een hemolytische substantie vormt.Het is nu bekend dat PLA2 rechtstreeks kan inwerken op de fosfolipiden van het erytrocytenmembraan, waardoor de structuur van het erytrocytenmembraan wordt vernietigd en directe hemolyse wordt veroorzaakt;Het kan ook werken op serum of toegevoegde lecithine om hemolytische lecithine te produceren, die inwerkt op rode bloedcellen om indirecte hemolyse te produceren.Hoewel PLA2 overvloedig aanwezig is in de vier families van slangengif, is het gehalte aan enzymen in verschillende slangengif iets anders.Ratelslang (C
Slangengif vertoonde slechts zwakke PLA2-activiteit.Tabel 3-11-11 illustreert de vergelijking van PLA2-activiteit van 10 belangrijke giffen van giftige slangen in China.
Tabel 3-11-11 Vergelijking van fosfolipase VIII-activiteiten van 10 slangengif in China
Slangengif
Vet release
alifatisch zuur,
Cjumol/mg)
Hemolytische activiteit CHU50/^ g * ml)
Slangengif
Geef vetzuren vrij
(^raol/mg)
Hemolytische activiteit “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elf
Micracephal ophis
vijf komma een nul
kalyspallas
8. 68
tweeduizend achthonderd
gracilis
V, acuut
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
drie komma acht twee
honderdveertig
Bnugarus fascitatus
7,56
tweehonderdtachtig
B. multicinctus
een komma negen zes
tweehonderdtachtig
Adder een russelli
zeven komma nul drie
T, mucrosquamatus
een komma acht vijf
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Scheiding en zuivering
Het gehalte aan PLA2 in slangengif is groot en het is stabiel tegen hitte, zuur, alkali en denaturatiemiddel, zodat het gemakkelijk te zuiveren en te scheiden is van PLA2.De gebruikelijke methode is om eerst gelfiltratie uit te voeren op het ruwe gif, vervolgens ionenuitwisselingschromatografie uit te voeren en de volgende stap kan worden herhaald.Opgemerkt moet worden dat het vriesdrogen van PLA2 na ionenuitwisselingschromatografie geen aggregatie mag veroorzaken, omdat het vriesdroogproces vaak de ionische sterkte in het systeem verhoogt, wat een belangrijke factor is die aggregatie van PLA2 veroorzaakt.Naast de bovenstaande algemene methoden zijn ook de volgende methoden toegepast: ① Wells et al.② De substraatanaloog van PLA2 werd gebruikt als ligand voor affiniteitschromatografie.Dit ligand kan zich binden aan PLA2 in slangengif met Ca2+.EDTA wordt meestal gebruikt als eluens.Nadat Ca2+ is verwijderd, neemt de affiniteit tussen PLA2 en ligand af en kan het van ligand worden gescheiden.Anderen gebruiken 30% organische oplossing of 6mol/L ureum als eluens.③ Hydrofobe chromatografie werd uitgevoerd met PheiiylSephar0SeCL-4B om sporen PLA2 in cardiotoxine te verwijderen.④ Anti-PLA2-antilichaam werd gebruikt als ligand om affiniteitschromatografie op PLA2 uit te voeren.
Tot nu toe is een groot aantal slangengif PLAZ gezuiverd.Tu et al.(1977) somde PLA2 gezuiverd uit slangengif op vóór 1975. De afgelopen jaren is er elk jaar een groot aantal artikelen verschenen over de scheiding en zuivering van PLA2.Hier concentreren we ons op de scheiding en zuivering van PLA door Chinese geleerden.
Chen Yuancong et al.(1981) scheidde drie PLA2-soorten uit het gif van Agkistrodon halys Pallas in Zhejiang, die kunnen worden onderverdeeld in zure, neutrale en alkalische PLA2 volgens hun iso-elektrische punten.Volgens zijn toxiciteit is neutraal PLA2 giftiger, dat is geïdentificeerd als presynaptisch neurotoxine Agkistrodotoxine.Alkalisch PLA2 is minder giftig en zuur PLA2 heeft bijna geen toxiciteit.Wu Xiangfu et al.(1984) vergeleek de kenmerken van drie PLA2's, waaronder molecuulgewicht, aminozuursamenstelling, N-terminaal, iso-elektrisch punt, thermische stabiliteit, enzymactiviteit, toxiciteit en hemolytische activiteit.De resultaten toonden aan dat ze een vergelijkbaar molecuulgewicht en thermische stabiliteit hadden, maar significante verschillen hadden in andere aspecten.Wat de enzymactiviteit betreft, was de zure enzymactiviteit hoger dan de alkalische enzymactiviteit;Het hemolytische effect van alkalisch enzym op rode bloedcellen van ratten was het sterkst, gevolgd door neutraal enzym en zuur enzym nauwelijks gehemolyseerd.Daarom wordt gespeculeerd dat het hemolytische effect van PLAZ verband houdt met de lading van het PLA2-molecuul.Zhang Jingkang et al.(1981) hebben Agkistrodotoxine-kristallen gemaakt.TuGuangliang et al.(1983) rapporteerde dat een toxisch PLA met een iso-elektrisch punt van 7,6 werd geïsoleerd en gezuiverd uit het gif van Vipera rotundus uit Fujian, en zijn fysische en chemische eigenschappen, aminozuursamenstelling en de sequentie van 22 aminozuurresiduen aan de N -terminaal werden bepaald.Li Yuesheng et al.(1985) isoleerde en zuiverde nog een PLA2 uit het gif van Viper rotundus in Fujian.De subeenheid van de PLA2 * is 13 800, het iso-elektrische punt is 10,4 en de specifieke activiteit is 35/xnioI/miri mg。 Met lecithine als substraat is de optimale pH van het enzym 8,0 en de optimale temperatuur is 65 ° C LD5 intraveneus geïnjecteerd bij muizen.Het is 0,5 ± 0,12 mg/kg.Dit enzym heeft duidelijke anticoagulerende en hemolytische effecten.Het giftige PLA2-molecuul bestaat uit 123 resten van 18 soorten aminozuren.Het molecuul is rijk aan cysteïne (14), asparaginezuur (14) en glycine (12), maar bevat slechts één methionine en het N-uiteinde is een serineresidu.Vergeleken met PLA2 geïsoleerd door Tuguang, lijken het molecuulgewicht en het aantal aminozuurresiduen van de twee iso-enzymen erg op elkaar, en de aminozuursamenstelling lijkt ook erg op elkaar, maar het aantal asparaginezuur- en prolineresiduen is enigszins anders.Guangxi king cobra slangengif bevat rijk PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) isoleerde een PLA2 uit het gif, dat een specifieke activiteit heeft die 3,6 keer hoger is dan het oorspronkelijke gif, een molecuulgewicht van 13.000, een samenstelling van 122 aminozuurresiduen, een iso-elektrisch punt van 8,9 en een goede thermische stabiliteit.Uit de elektronenmicroscoopobservatie van het effect van basisch PLA2 op rode bloedcellen, kan worden gezien dat het een duidelijk effect heeft op het membraan van menselijke rode bloedcellen, maar geen duidelijk effect heeft op rode bloedcellen van geiten.Dit PLA2 heeft een duidelijk vertragend effect op de elektroforetische snelheid van rode bloedcellen bij mensen, geiten, konijnen en cavia's.Chen et al.Dit enzym kan de door ADP, collageen en natriumarachidonzuur geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie remmen.Wanneer de PLA2-concentratie 10/xg/ml ~ 100 jug/ml is, wordt de bloedplaatjesaggregatie volledig geremd.Als gewassen bloedplaatjes als materialen werden gebruikt, kon PLA2 aggregatie niet remmen bij een concentratie van 20 mg/ml.Aspirine is een remmer van cyclo-oxygenase, dat het effect van PLA2 op bloedplaatjes kan remmen.PLA2 kan de aggregatie van bloedplaatjes remmen door arachidonzuur te hydrolyseren om tromboxaan A2 te synthetiseren.De oplossingsconformatie van PLA2 geproduceerd door het gif van Agkistrodon halys Pallas in de provincie Zhejiang werd bestudeerd door middel van circulair dichroïsme, fluorescentie en UV-absorptie.De experimentele resultaten toonden aan dat de conformatie van de hoofdketen van dit enzym vergelijkbaar was met die van hetzelfde soort enzym van andere soorten en geslachten, dat de skeletconformatie een goede hittebestendigheid had en dat de structurele verandering in een zure omgeving omkeerbaar was.De combinatie van activator Ca2+ en enzym heeft geen invloed op de omgeving van tryptofaanresiduen, terwijl de remmer Zn2+ het tegenovergestelde doet.De manier waarop de pH-waarde van de oplossing de enzymactiviteit beïnvloedt, verschilt van de bovenstaande reagentia.
In het proces van PLA2-zuivering van slangengif is een voor de hand liggend fenomeen dat een slangengif twee of meer PLA2-elutiepieken bevat.Dit fenomeen kan als volgt worden verklaard: ① door het bestaan van isozymen;② Eén soort PLA2 wordt gepolymeriseerd tot een verscheidenheid aan PLA2-mengsels met verschillende molecuulgewichten, waarvan de meeste in het bereik van 9.000~40.000 liggen;③ De combinatie van PLA2 en andere componenten van slangengif bemoeilijkt PLA2;④ Omdat de amidebinding in PLA2 wordt gehydrolyseerd, verandert de lading.① en ② komen vaak voor, met slechts een paar uitzonderingen, zoals PLA2 in CrWa/w slangengif
Er zijn twee situaties: ① en ②.De derde aandoening is gevonden in PLA2 in het gif van de volgende slangen: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestijnse adder, zandadder en verschrikkelijke ratelslang km.
Het resultaat van geval ④ zorgt ervoor dat de migratiesnelheid van PLA2 verandert tijdens elektroforese, maar de aminozuursamenstelling verandert niet.Peptiden kunnen worden afgebroken door hydrolyse, maar over het algemeen zijn ze nog steeds aan elkaar gebonden door disulfidebindingen.Het gif van de oostelijke pitratelslang bevat twee vormen van PLA2, respectievelijk type a en type p PLA2 genoemd.Het verschil tussen deze twee soorten PLA2 is slechts één aminozuur, dat wil zeggen dat glutamine in het ene PLA2-molecuul wordt vervangen door glutaminezuur in het andere PLA2-molecuul.Hoewel de exacte reden voor dit verschil niet duidelijk is, wordt algemeen aangenomen dat het verband houdt met de deaminering van PLA2.Als PLA2 in het Palestijnse addergif warm wordt gehouden met het ruwe gif, zullen de eindgroepen in zijn enzymmoleculen meer worden dan voorheen.Van C PLA2 geïsoleerd uit slangengif heeft twee verschillende N-terminals en het molecuulgewicht is 30.000. Dit fenomeen kan worden veroorzaakt door het asymmetrische dimeer van PLA2, dat vergelijkbaar is met het symmetrische dimeer gevormd door PLA2 in het gif van de oostelijke diamantrugratelslang en westelijke diamantrugratelslang.De Aziatische cobra bestaat uit vele ondersoorten, waarvan sommige niet erg definitief zijn qua classificatie.Wat vroeger de Cobra Outer Caspian-ondersoort werd genoemd, wordt nu bijvoorbeeld erkend
Het moet worden toegeschreven aan de Outer Caspian Sea Cobra.Omdat er veel ondersoorten zijn en ze met elkaar vermengd zijn, varieert de samenstelling van slangengif sterk vanwege verschillende bronnen, en het gehalte aan PLA2-isozymen is ook hoog.Bijvoorbeeld cobragif
Ten minste 9 soorten PLA2-isozymen van r ^ ll soorten werden gevonden in, en 7 soorten PLA2-isozymen werden gevonden in het gif van de cobra-ondersoort Caspian.Durkin et al.(1981) bestudeerde het PLA2-gehalte en het aantal isozymen in verschillende slangengif, waaronder 18 cobragif, 3 mambagif, 5 addergif, 16 ratelslanggif en 3 zeeslanggif.Over het algemeen is de PLA2-activiteit van cobragif hoog, met veel isozymen.De PLA2-activiteit en isozymen van addergif zijn gemiddeld.De PLA2-activiteit van mambagif en ratelslanggif is zeer laag of geen PLA2-activiteit.De PLA2-activiteit van zeeslangengif is ook laag.
In de afgelopen jaren is niet gemeld dat PLA2 in slangengif bestaat in de vorm van actief dimeer, zoals de oostelijke rhombophora ratelslang (C. slangengif bevat type a en type P PLA2, die beide zijn samengesteld uit twee identieke subeenheden , en alleen dimerase heeft
Activiteit.Shen et al.stelde ook voor dat alleen het dimeer van PLA2 van het slangengif de actieve vorm van het enzym is.De studie van de ruimtelijke structuur bewijst ook dat PLA2 van de westelijke diamantrugratelslang bestaat in de vorm van een dimeer.Visetende verbinding
Er zijn twee verschillende PLA ^ Ei en E2 van slangengif, waarin 仏 bestaat in de vorm van een dimeer, het dimeer is actief en het gedissocieerde monomeer is inactief.Lu Yinghua et al.(1980) bestudeerde verder de fysische en chemische eigenschappen en reactiekinetiek van E. Jayanthi et al.(1989) isoleerde een basis PLA2 (VRVPL-V) uit het addergif.Het molecuulgewicht van het monomeer PLA2 is 10.000, dat dodelijke, anticoagulerende en oedeemeffecten heeft.Het enzym kan polymeren met verschillende molecuulgewichten polymeriseren onder de voorwaarde van PH 4,8, en de polymerisatiegraad en het molecuulgewicht van polymeren nemen toe met de toename van de temperatuur.Het molecuulgewicht van het polymeer gegenereerd bij 96 ° C is 53.100, en de PLA2-activiteit van dit polymeer neemt met twee toe
Posttijd: 18-nov-2022